IVT（体外转录）是mRNA生产工艺中至关重要的一步。一个良好的IVT体系能够大幅提升产量，减少原料使用，降低生产成本，同时确保mRNA分子的完整性、加帽率以及dsRNA杂质的渗入等核心质量指标。这进一步简化了下游纯化过程，并在整个工艺环节中起到了承上启下的关键作用。

IVT反应过程相对简单，标准IVT体系主要由DNA模板、T7RNA聚合酶（T7RNAP）、NTPs、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂和反应buffer等组成。DNA模板通常为PCR产物或线性化质粒，包含了T7启动子、5’UTR、CDS、3’UTR和Poly（A）等元件。NTP作为mRNA转录的底物，可以通过替换为修饰核苷酸，增强mRNA的稳定性和免疫原性等特性；无机焦磷酸酶则通过水解反应中产生的大量焦磷酸，提高了反应效率，而RNase抑制剂则用于抑制潜在的RNase污染。同时，T7RNAP在整个反应系统中扮演着核心的角色，负责识别DNA模板并将其转录为mRNA。

除了质粒模板的质量外，IVT的效果主要受T7RNAP和buffer体系的影响。T7RNA聚合酶能高效识别T7启动子序列，与DNA模板结合后，引导5’到3’方向的RNA合成。相比其他RNA聚合酶，T7RNAP具有高度的特异性，不需要其他蛋白质或辅助因子即可成功完成转录，这使其成为体外转录制备mRNA的最佳选择。

在T7RNAP的结构上，其各个部分类似于一个右手，分为一个N端结构域和一个C端结构域。C端结构域又进一步细分为不同的亚结构域，使得DNA模板可以有效结合。

通过采用DOE（实验设计）方法，研发团队探索了IVT反应参数对常规mRNA与saRNA产量及质量的影响，发现温度对长片段saRNA的完整性有显著影响。当温度从20℃提高到42℃时，saRNA的产量有所增加，但在超过32℃后，其完整性却急剧下降。因此，定向筛选低温转录的T7RNA聚合酶可能成为优化saRNA完整度的一种新途径。

此外，研究表明T7RNAP的热稳定突变体在高温条件下的转录可减少3’端过度延伸导致的dsRNA，且模板中编码poly（A）尾的设计对3’端过度延伸无影响。高温IVT产品在细胞转染中的免疫原性也相对较低。

在优化过程中，提升T7RNAP的耐高温性能是关键。通过结合高通量筛选平台，团队成功筛选出具有优良耐高温性能的T7RNAP突变体M16，其半衰期在52℃下提高了270倍，催化活性提升58倍。这一改进显著降低了转录产物中的dsRNA含量，呈现出与T7-WT在高温环境下的显著对比。

除了提高耐热性，降低转录副产物的方向同样受到关注。针对T7RNAP的低dsRNA特性，研究逐步筛选出与高活性和转录产量相关的突变体。同时，提升转录产物3’端一致性成为改造的方向，通过相关技术，发现多种突变体在这一指标上优于野生型T7RNAP。

IVT反应需要高性能的酶，但仅有优质酶远远不够，反应buffer的优化同样至关重要。IVT buffer通常包含多种组分，如盐类、pH缓冲剂及二价阳离子等，浓度和比例的变化将直接影响RNA聚合酶的活性、特异性和稳定性。

在Rosa等的研究中，使用贝叶斯优化方法对12个不同参数进行了有效优化，提升了mRNA的产量，特别是pH与镁离子浓度对IVT反应影响显著。

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